Revelada estrutura do complexo da Xanthomonas citri usado para eliminar outras espécies bacterianas

Cientistas usaram crio-microscopia eletrônica e obtiveram modelo com resolução de 3,3 Å
Por Maria Celia Wider

 

Na luta pela sobrevivência, bactérias atacam, defendem-se e competem entre si e com outros organismos pelo mesmo nicho. Essas interações levaram à evolução dos sistemas de secreção usados por bactérias para mediar a transferência de DNA e proteínas para alvos eucarióticos e procarióticos. Dentre eles, os sistemas de secreção tipo IV (T4S) são verdadeiras nanomáquinas onipresentes, sendo extensivamente investigados por cientistas interessados em entender seu funcionamento em nível molecular.

Usando a técnica de crio-microscopia eletrônica, o grupo do professor Shaker Chuck Farah, do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP, em colaboração com grupos no CNPEM em Campinas e Birkbeck College no Reino Unido, caracterizou a estrutura molecular do complexo central (core complex) do sistema T4S da bactéria Xanthomonas citri, causadora da doença cancro cítrico. Esse sistema é importante porque é utilizado pela X. citri para secreção de toxinas letais para outras espécies bacterianas.

“O sistema T4S da X. citri é estruturalmente similar aos sistemas usados para conjugação bacteriana e transferência horizontal de genes e mais distantemente similar aos sistemas de patógenos  como Helicobacter pylori, que causa gastrite e úlcera péptica, ou Legionella pneumophila, que causa a doença do legionário. Caracterizar arquitetonicamente o core complex  desse  sistema foi importante para obtermos informações sobre ambos os tipos de sistema”, afirmou o pós-doutorando Germán Sgro, primeiro autor do artigo publicado na revista Nature Microbiology.

Segundo Chuck Farah, a elucidação dessa estrutura expande o conhecimento dos detalhes moleculares da organização, montagem e evolução do sistema T4S. “Atualmente podemos estudar grandes estruturas, complexos proteicos que representam o contexto biológico com mais fidelidade”, afirmou.

 

Sistemas de secreção tipo IV

 

Os sistemas de secreção tipo IV são complexos proteicos que transportam proteínas e DNA através das membranas bacterianas para o interior de outras células. Como mediadores da conjugação bacteriana, os sistemas T4S têm um papel essencial na propagação de genes que conferem resistência a antibióticos. Também, como fatores de virulência, eles secretam DNAs transformadores em plantas, levando ao crescimento de tumores, e proteínas efetoras em células animais, causando doenças infecciosas.

Muitas bactérias da família Xanthomonadaceae, que ocupam diversos nichos ambientais, carregam um sistema T4S diferente dos achados em outras bactérias já estudadas, cuja função até então era desconhecida.

Em 2015, o grupo de Chuck Farah publicou um artigo na revista Nature Communications com resultados mostrando que o sistema T4S da bactéria Xanthomonas citri confere às células a capacidade de matar outras bactérias de maneira dependente de contato, por meio da transferência de toxinas. Os pesquisadores mostraram a versatilidade do sistema T4S e seu papel determinante na competição bacteriana interespécies. “Análises dos genomas sequenciados de outras bactérias permitiram determinar que este tipo de T4S é encontrado principalmente em bactérias da mesma família (Xanthomonadaceae)”, comenta Chuck Farah. No entanto, para entender como esses sistemas funcionam era preciso conhecer sua estrutura molecular, e esse foi o objetivo do grupo, que resultou, como um importante primeiro passo, na caracterização da estrutura do seu core complex.
 

Os sistemas T4S são normalmente compostos por 12 subunidades, denominadas de VirB1-11 e VirD4, que formam dois conjuntos principais: o complexo da membrana interna e o core complex, associado com ambas as membranas bacterianas. No sistema T4S da X. citri, o core complex é composto por 42 subunidades, com 14 repetições das proteínas VirB7, VirB9 e VirB10, formando um tetradecâmero de trímeros. Caracterizar este complexo foi um desafio, tanto pelo tamanho da estrutura (1.13 MegaDaltons) quanto pelo fato de ser um complexo associado com membranas.

 

 

 

 

Germán Sgro conta como abordaram o desafio: primeiro, os pesquisadores clonaram os genes da X. citri que codificam as proteínas do core complex para um sistema de expressão na bactéria Escherichia coli, a qual conseguiu tanto expressar como montar corretamente o complexo na sua membrana. O passo seguinte foi processar as amostras de forma a extrair os complexos das membranas da bactéria sem destruí-los.

Para obter o modelo da estrutura, eles começaram empregando a técnica de microscopia eletrônica de contraste negativo (negative-staining EM), em colaboração com grupo do físico Rodrigo V. Portugal, do Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano) do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), em Campinas.

A etapa seguinte foi usar a crio-microscopia eletrônica (cryo-EM), técnica de biologia estrutural ainda pouco utilizada no Brasil, que permite a obtenção de modelos de alta resolução de macromoléculas. Com o grupo de Rodrigo Portugal, foram determinadas as condições específicas de preparação das amostras para análise por cryo-EM. Isso levou a uma colaboração com o grupo do Prof. Gabriel Waksman, da University College of London e Birkbeck College, que mantém um centro de excelência na área de cryo-EM e onde Germán trabalhou por 12 meses em 2016-2017. Durante esta visita, ele conseguiu coletar um conjunto de dados de aproximadamente 1.500 imagens e 185.000 partículas, que foi utilizado para criar um mapa de densidade eletrônica com resolução de 3,3 Å (um Angström é igual a 10-10m). Este mapa permitiu visualizar os detalhes moleculares do core complex de X. citri.

Depois de modelar tridimensionalmente as sequencias de aminoácidos, os pesquisadores estudaram as interações entre as subunidades da estrutura, com o objetivo de entender qual a importância de cada tipo de interação.

Ao mesmo tempo, Chuck Farah ressalta que foi importante a colaboração com o grupo do professor Roberto K. Salinas, do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP, com quem já estava investigando a interação entre as proteínas VirB10 e VirB9 por ressonância magnética nuclear. As informações obtidas por esta técnica foram usadas para interpretação de uma região particularmente interessante do mapa eletrônico obtido por crio-microscopia eletrônica.

Os pesquisadores também fizeram uma análise funcional das características da estrutura do core complex. Eles introduziram diversas mutações nas subunidades VirB7, VirB9 e VirB10, em lugares diferentes, tanto na X. citri selvagem (wild type) quanto em uma cepa na qual a subunidade VirB10 estava fundida com uma molécula de GFP (green fluorescent protein). As mutantes foram usadas pelo pós-doutor William Cenens em vários ensaios de competição e de matança bacteriana (killing assays) e comparadas com as bactérias wild type quanto à eficácia em matar os seus alvos (E. coli). Além disso, o Dr. Cenens observou as bactérias mutantes em microscópio de fluorescência, o que permitiu contar o número de complexos em cada célula e correlacionar esse número com a eficiência na matança.

 

Ferramenta biotecnológica

 

Estudos sobre a estrutura e função do sistema de secreção IV da X. citri ampliam o conhecimento sobre os mecanismos bacterianos de secreção e podem ter impacto na área médica.

Por exemplo, sistemas similares aos da X. citri são encontrados em bactérias do gênero Stenotrophomonas, que é uma bactéria ambiental, mas que às vezes é encontrada em infecções hospitalares. É possível que o sistema T4S possa ajudá-la a se instalar em algum nicho ou hospedeiro específico, o que torna importante estudá-la do ponto de vista da clínica.

A atividade bactericida promovida por este sistema T4S também é um foco de interesse. No artigo de 2015, os pesquisadores listaram as toxinas – ou, mais formalmente, os efetores – secretadas pela X. citri, e comentam que estão ativamente estudando seus alvos moleculares, que são diversos dentro da célula-alvo: lipídios nas membranas; peptidoglicanos, que são polímeros que dão estrutura para a parede celular bacteriana; e nucleases, que podem degradar DNA ou RNA dentro da célula-alvo.

Neste sentido, uma possibilidade de aplicação, segundo Germán Sgro, é o uso do sistema T4S como ferramenta biotecnológica para transferir um conjunto de efetores especificamente desenhado para combater outras bactérias não desejadas.

O artigo Cryo-EM structure of the bacteria-killing type IV secretion system core complex from Xanthomonas citri, de Germán G. Sgro, Tiago R. D. Costa, William Cenens, Diorge P. Souza, Alexandre Cassago, Luciana Coutinho de Oliveira, Roberto K. Salinas, Rodrigo V. Portugal, Chuck S. Farah & Gabriel Waksman, pode ser lido por assinantes em

https://www.nature.com/articles/s41564-018-0262-z