Enzimas de restrição são proteínas
encontradas em bactérias que reconhecem uma curta
sequência de DNA
específica e clivam a dupla fita em um ponto específico.
Estas enzimas fazem parte de um sistema de defesa
contra
DNA de fagos, os vírus de bactérias. Tal sistema é
composto por um par de enzimas, às vezes fundidas em uma
só proteína:
1. uma enzima (ou domínio)
metila
certos sítios do DNA da bactéria, protegendo-os
contra auto-clivagem,
2. uma segunda enzima (enzima de restrição) reconhece
estes sítios que não estão metilados em fagos,
clivando-os. Assim, a bactéria possui um meio de clivar somente
o DNA de invasores, mantendo o seu próprio intacto.
Existem centenas de
enzimas de restrição, vamos utilizar
a BglI da bactéria Bacillus
globigiicomo nosso modelo.
Esta enzima
é uma endonuclease, ou
seja, uma enzima que cliva nucleotídeos internos a uma
sequência de DNA. As exonucleases
clivam o DNA a partir de uma extremidade livre.
O primeiro tipo de enzima de restrição conhecida (tipo I) reconhece 6 pares de base
consecutivos de uma sequência de DNA.
A BglI é uma enzima de restrição do tipo II que reconhece uma
sequência de DNA interrompida:
5'-GCCNNNNNGGC-3'. A enzima
reconhece
a sequência marcada em amarelo
e cliva entre a quarta e
quinta bases anotadas como N.
Lembremos que esta enzima liga-se e cliva uma dupla fita de DNA. Note que o
reverso complementar da sequência é ela mesma:
5'-GCCNNNNNGGC-3' 3'-CGGNNNNNCCG-5'
Dessa forma, o fato
da enzima clivar a sequência alvo entre a quarta e quinta bases,
implica em um corte simétrico (indicado por |):
5'-GCCNNNN|NGGC-3' 3'-CGGN|NNNNCCG-5'
Veja uma
animação sobre a função destas enzimas.
ver
animação
Agora vamos estudar como a estrutura desta proteína está
associada
à sua função.
carregar modelo
atômico
da enzima de restrição BglI
A fita de DNA está colorida de laranjae a
enzima de azul.
As bases de DNA estão coloridas em vermelho e as
pontes de hidrogênio entre elas em branco.
Estrutura
da BglI
Gire a molécula a vontade e perceba
que o DNA encontra-se dentro de uma fenda formada pela enzima. Ao todo,
14 pares de bases são abrigados pela enzima. A estrutura desta
proteína permite que tal contato se estabeleça, criando um ambiente apropriado para a clivagem.
Como muitas proteínas, a BglI é na
verdade um homodímero.
colorir
monômeros separadamente
Gire a
molécula
para verificar a simetria da estrutura formada.
No caso desta
enzima de restrição, o fato de ser um homodímero
permite que a proteína reconheça e intereja de forma
simétrica com a sequência de DNA que também
é simétrica.
Reconhecimento do DNA pela enzima
Para
facilitar a visualização, vamos visualizar apenas alguns
aminoácidos da enzima e a dupla fita de DNA.
mostrar
somente aminoácidos 62-159 e 162-282
A sequência de DNA a ser reconhecida pela enzima está
indicada em amarelo.
5'-GCCNNNNNGGC-3' 3'-CGGNNNNNCCG-5'
mostrar
sequência a ser reconhecida no modelo (em amarelo)
O reconhecimento do
DNA pela enzima se dá pelo contato de uma região
específica da proteína com os nucleotídeos em
amarelo.
mostrar a
região de reconhecimento na BglI
(em roxo)
Perceba que a
proteína envolve a dupla fita.
ver raios
atômicos
Podemos distinguir
as diferentes regiões do DNA que são contactadas pela
proteína.
ver região
da proteína que faz contato com o
sulco maior (folhas beta 4, 10 e 11 - resíduos 154-157, 262-279,
278-281)
ver região da proteína que
faz contato com o
sulco menor (laço entre alfa-hélices 3 e 4 -
resíduos 59-82)
A maior parte
dos contatos entre proteína e DNA é estabelecido
através
de pontes de hidrogênio.
Clivagem do DNA
Após o
reconhecimento da sequência GCCNNNNNGGC, o papel da enzima é clivar
a sequência NNNNN. Isto é feito com alta eficiência
porque o quarto e quinto nucleotídeos estão localizados
muito próximos ao sítio catalítico.
destacar
aminoácidos Glu87, Asp116,
Asp142, Lys144 dos
sítios
catalíticos (um em cada monômero, em branco).
ver quarto e quinto
nucleotídeos da sequência de DNA
Note que devido à curvatura da molécula de DNA e da
simetria da sequência, o quarto
e quinto nucleotídeos das duas fitas localizam-se do
mesmo lado e próximos aos dois sítios catalíticos.
Como se dá a clivagem, mecanisticamente?
O ponto exato de clivagem é a
ligação fosfodiéster N4pN5
entre as
bases N4e N5. Mais
precisamente, o átomo de fosfato da ligação
é atacado por um
oxigênio de uma molécula de água, posicionada no
sítio ativo com o auxílio de átomos de Mg+2
e dos aminoácidos do sítio catalítico.
Ou seja, a função dos aminoácidos do sítio
catalítico é organizar outros átomos de tal forma
que a reação química de hidrólise da
ligação fosfodiéster possa ser realizada.
destacar átomo
de
fósforo da ligação fosfato entre os
nucleotídeos N4e N5.