Aspectos biológicos e estruturais do estresse oxidativo na via de transdução de sinal da oncoproteína SRC.

Src é uma oncoprotéina produto do oncogene viral v-src que apresenta alta atividade quinásica em diversos tipos de tumores humanos promovendo alterações intracelulares que levam a malignicidade dos mesmos tornando-os metastáticos. A atividade de Src é regulada negativamente por Csk (C-terminal Src kinase), uma proteína que pode ser recrutada para várias localizações subcelulares sob ativação de quinases da família de Src (SFK), como por exemplo, as regiões de caveolos e “rafts” de membrana em condições de estresse oxidativo (H2O2), quando da ligação de hormônios (Insulina) ou de fatores de crescimento (EGF) aos seus receptores transmembranares. Um dos domínios de Csk que não tem atividade catalítica, mas tem função essencial na ligação a outros substratos protéicos é o SH2. O estado de oxidação de uma única ponte dissulfeto encontrada no interior do domínio SH2 de Csk altera sua atividade catalítica in vitro. A proposta deste projeto é investigar o impacto do estado de oxidação do domínio SH2 de Csk na sua atividade catalítica, na sua localização subcelular e no seu envolvimento nos mecanismos de sinalização intracelular envolvendo SFKs. Também pretendemos estudar se os estados redox intracelulares nas proximidades da localização de Csk (membrana plasmática e mitocôndria) afetam sua ligação e atividade in vivo, ou seja, em culturas de linhagens celulares submetidas a diferentes estímulos extracelulares. A abordagem experimental envolverá transfecções de diferentes linhagens celulares humanas com a proteína Csk selvagem e mutada (nas cisteínas envolvidas na ponte dissulfeto), seguidas de experimentos de imunoprecipitação, imunoblot e imunofluorescência para Csk e seus efetores intracelulares conhecidos (Figura 3). A identificação de ligantes desconhecidos de Csk a partir das imunoprecipitações deverá ser acompanhada por análises de espectrometria de massas. E, além disso, utilizando a técnica de “phospho- peptide array” identificamos inúmeros peptídeos de 15aa ligantes e não ligantes de Csk em seus diferentes estados de oxidação. Estes serão investigados quanto ao seu aspecto estrutural através de modelagem molecular e testados in silico e in vitro quanto a sua capacidade de ligação a Csk e competição com seus ligantes intracelulares a fim de interferir na via de sinalização da proteína Src, funcionando assim como verdadeiras moléculas de interesse e potencial terapêuticos.