SERVIÇO DE SEQUENCIAMENTO DE DNA (método Sanger)      

O Serviço de Sequenciamento de DNA (SSDNA) está em funcionamento desde setembro de 2002 no Departamento de Bioquímica – Instituto de Química USP (IQ) sob a responsabilidade da Profa. Dra. Suely Lopes Gomes. A partir de 23 de novembro de 2016  ele passou  a pertencer à Central Analítica do IQ, não alterando em nada a rotina do SSDNA.

Está disponível para usuários do Instituto de Química, demais unidades da USP e outras Instituições de ensino e pesquisa brasileiras.

Utilizamos sequenciadores ABI PRISM® 3130XL GeneticAnalyzer /HITACHI (16 capilares, 50 cm), instalados no Bloco 09 inferior, sala 908.

PARA UTILIZAR O SERVIÇO:

• Agendar pelo e-mail seqdnaiq@iq.usp.br com os especialistas responsáveis e aguardar um comunicado para a orientação de entrega das amostras.

• As amostras deverão ser preparadas cuidadosamente pelos usuários, utilizando “kits” comerciais de preparação e purificação de DNA e, em caso de dúvida, para a reação de sequenciamento e precipitação das amostras, utilizar protocolos sugeridos pelo Serviço.

• O fluoróforo que deverá ser utilizado na reação de sequenciamento é o BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit da Applied Biosystems.

• Não há número mínimo de amostras, mas se o número de amostras entregues for menor do que 16 amostras, estas deverão esperar para completar uma corrida (16 amostras).

• Os resultados serão enviados ao usuário por e-mail no formato .ab1 e no formato  .seq,  e poderão ser analisados utilizando os programas Chromas, BioEdit ou Sequence Scanner (“softwares” de análise de sequência obtidos gratuitamente na internet).

• Favor entrar em contato para solicitar orçamentos ou valores cobrados

COMO EFETUAR O PAGAMENTO:

• Via Fundação da Universidade de São Paulo (FUSP) com nf-e e boleto bancário.

• Envie os seguintes dados para o SSDNA:

• Nome

• CPF
• Endereço com CEP
• Telefone
• E-mail
• Valor a ser pago
• Número do projeto (FAPESP ou CNPq)

Especialistas responsáveis pelo Serviço:

Wilton José da Rocha Lima e Adriana Yamaguti Matsukuma

e-mail do SSDNA: seqdnaiq@iq.usp.br

Telefone: 11 3091-3212 R-19

Instituto de Química USP

Av. Prof. Lineu Prestes, 748 - BLOCO 12 sala 1211

CEP 05508-000 São Paulo - SP

 

SOLUÇÕES PARA O SEQUENCIAMENTO
 

Consulte o blog abaixo e tire suas dúvidas:

http://lifesequencing.blogspot.com.br/p/troubleshooting-sequenciamento.html

http://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-troublesho...

 

Acesse:

DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis Guide 
 
 
 
Protocolo de Sequenciamento para DNA plasmidial ou produto de PCR usando Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems) 
 X  ul DNA (~100ng-200ng SEM CONTAR O VETOR) ou PRODUTO DE PCR

 3 ul primer (3,2pmoles/ul = 10pmoles/reação)

3 ul 5X sequencing buffer (se BigDye versão 3.0 ou anterior, usar save money)

2 ul BigDye v3.1

Completar  volume final com H20 para 15ul

Dar um pulso de 1000 rpm .

 

Programa Termociclador:
                       96oC  2 min
35 ciclos  de                96oC  45 seg

                                    50oC  30 seg (variável de acordo com o primer),

                                    60oC  4 min

 

                                   4oC infinito

 

Precipitação  da Reação de Sequenciamento usando glicogênio:
     1. Aos 15 ul da reação de sequenciamento adicionar 25 ul do mix** de precipitação.

     2. Vortexar e manter em gelo por 15 minutos ou freezer -20oC.

     3. Centrifugar 4.000 rpm por 20 minutos à temperatura ambiente.

     4. Inverter e descartar o excesso, dando a seguir um pulso de 1000 rpm com a placa invertida.

     5. Adicionar 50ul de etanol 70% gelado por reação e NÃO VORTEXAR.

     6. Repetir a centrifugação (10 min) e a drenagem dos tubos (passos 3 e 4).

     7. Secar por 1 hora em lugar protegido da luz, ou 1 minuto 96oC no termociclador aberto. 

 

    Se for enviar ao Serviço de Sequenciamento de DNA não adicionar nada, deixando as amostras seladas e envoltas com papel alumínio à -20oC. 

    Rotular a tampa e o corpo do tubo numericamente.

 

**Mix de precipitação para uma placa 96 wells: 2750ul de etanol 100% gelado; 110 ul de 3M NaOAc pH5,2; 110ul de  glicogênio 1mg/ml

 

ORIENTAÇÃO PARA A ENTREGA DAS AMOSTRAS AO SSDNA
 

Siga as instruções abaixo:

 

1. Agendar por e-mail:  seqdnaiq@iq.usp.br

As amostras agendadas deverão ser deixadas no freezer localizado na sala 06 (bloco 0, inferiror, ao lado da escada).

Este freezer é branco e tem uma etiqueta "SSDNA" na parte frontal.

 

2. As amostras deverão estar rotuladas - numericamente e em ordem crescente - na tampa e no corpo de cada tubo. 

Organizá-las nas caixas plásticas dentro dos sacos plásticos, do tipo zip, que estarão no freezer do SSDNA.

 

3. As amostras deverão estar acompanhadas pelo formulário preenchido, contendo as seguintes informações:

 

NOME DO USUÁRIO E E-MAIL:            usuário@iq.usp.br

NOME DO ORIENTADOR: Prof. Dr. Orientador

TELEFONE PARA CONTATO: 3091-XXXX

INSTITUIÇÃO DE ORIGEM:   XXX USP

DATA DA ENTREGA:  XX de XX de XXXX

NÚMERO DE AMOSTRAS E SEUS RESPECTIVOS NOMES :  4 quatro

 

COM TAMANHO APROXIMADO DOS DNAS A SEREM SEQUENCIADOS:

1- pGEM_T7 – 400bp

2- pGEM_SP6 – 400bp

3- pGEM_REVERSE – 400bp

4- pGEM_FOWARD – 400bp

 

4. Favor anotar no caderno de bordo (localizado ao lado do freezer) os dados necessários.

5. AS AMOSTRAS QUE NÃO APRESENTAREM ESTAS ORIENTAÇÕES NÃO SERÃO SEQUENCIADAS E AGUARDARÃO ATÉ QUE O USUÁRIO ORGANIZE-AS CORRETAMENTE.